Термоденатурация гемоглобина и мембраносвязанных белков эритроцитов человека после обработки озоном
Буряк И.А., Зинченко В.Д, Зинченко А.В., Семенченко А.Ю., Воловельская Е.Л.
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
г. Харьков, Украина,
В настоящее время накоплено достаточно много данных о воздействии озона на клетки крови. В работах [5, 2] указывается, что под влиянием озона меняется текучесть мембран и детергентоустойчивость эритроцитов. По данным [7], обработка крови пациентов озоном вызывает повышение текучести липидов эритроцитарных мембран, повышение деформируемости и фильтруемости эритроцитов, что способствует улучшению их кислородтранспортной функции. При этом обработка крови терапевтическими дозами озона (10 – 40 мг/мл газа на 1 мл крови) не приводит к возрастанию перекисного окисления мембранных липидов. Эти результаты указывают на то, что эритроциты цельной крови защищены различными плазменными антиоксидантами. Однако после обработки озоном эритроцитов, отмытых от плазмы солевыми растворами, обнаруживается снижение их деформируемости и фильтруемости [7].
Таким образом, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о неоднозначности действия озона на эритроциты, причем молекулярные механизмы биологического действия озона до конца не ясны.
Цель данной работы — исследовать действие озона на термостабильность гемоглобина и мембраносвязанных белков эритроцитов. Исследования проводили методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) на приборе ДАСМ-4 (Пущино, СКББП).
Эритроциты выделяли из донорской крови человека, полученной на Харьковской областной станции переливания крови. Для этого их трижды отмывали от плазмы физиологическим раствором (0,15 М NaCl), центрифугируя при 800 g в течение 10 минут. Мембраны и гемоглобин получали путем осмотического лизиса эритроцитов [4].
Озон для исследований получали из газообразного кислорода производства Харьковского кислородного завода (ГОСТ 5583-78) кислорода на озонаторе безбарьерного типа. Физиологический раствор во флаконах объемом 50 – 200 мл барботировали озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 30 мг/л при потоке 2 л/мин. Различные дозы озона вводили в исследуемые образцы путем добавления озонированного физиологического раствора с требуемыми концентрациями озона. Концентрацию озона в растворе определяли по величине экстинкции на длине волны 255 нм на спектрофотометре Specord UV VIS.
Применяли два способа воздействия озона на мембраны и гемоглобин эритроцитов. Озоном обрабатывали цельные клетки, из которых затем выделяли гемоглобин и тени для калориметрических исследований, или изолированные мембраны и гемоглобин, предварительно выделенные из эритромассы.
Анализ полученных термограмм показал, что дестабилизирующее действие озонана молекулы изолированного гемоглобина начинает проявляться при дозе озона 5,93 г О3 /моль Нb, что соответствует конечной концентрации озона0.8 мг /л раствора гемоглобина. Форма термограмм денатурации гемоглобина при высоких дозах озона – 26,9 г О3 /моль Нb (4,3 мгО3/л раствора)и 38,7 г О3 /моль Нb (6 мгО3/л раствора) дает основание для предположения о разрыхлении молекул гемоглобина. На это указывает уширение пиков денатурации. Монотонный рост полуширины пиков плавления гемоглобина при повышении дозы озона можно объяснить также увеличением вклада метгемоглобина.
Форма пика термоденатурации гемоглобина, полученного из озонированных эритроцитов, при дозе озона 9 мгО3 /л также свидетельствует о разрыхлении молекул гемоглобина, однако изменения формы пика выражены в меньщей степени, чем при озонировании белка в изолированном состоянии.
При обработке теней дозой озона 0,13 мгО3/г белка, что соответствует 0,2 мгО3/л суспензии теней, регистрируются 4 перехода — А, B, C, D, — характерные для теней эритроцитов [1; 6; 3]. Повышение дозы озона более 1,23 мг О3/г белка (2 мгО3/л суспензии теней) приводит к снижению интенсивности пиков, соответствующих указанным выше переходам, и при дозе 5,29 мг О3/г белка (7,4 мг/л суспензии) эндотермические пики, соответствующие переходам А и D выражены слабо, в то время как переходы В и С не регистрируются. Полученные результаты позволяют сделать вывод о полной денатурации белков, плавление которых соответствуют пикам В и С, под действием озона в результате окислительной деструкции. На термограммах теней, полученных из озонированных эритроцитов (0,2 мгО3/л суспензии), переходы не отличаются от таковых на термограммах теней эритроцитов, не подвергавшихся озонированию. При увеличении дозы озона до 9 мгО3/л суспензии интенсивность пиков плавления снижается, однако наличие всех переходов указывает на сохранение соответствующих мембраносвязанных белков.
Таким образом, установлено, что при озонировании гемоглобина и мембран в изолированном виде наиболее подверженными действию озона являются белки, плавление которых соответствует пикам В и С на термограммах. При озонировании цельных клеток гемоглобин и тени эритроцитов обнаруживают более высокую термоустойчивость, чем при их озонировании в изолированном виде. Данный эффект, по нашему мнению, может объясняться защитным действием антиоксидантных систем эритроцитов. Однако при высоких дозах озона компенсаторные возможности антиоксидантных систем исчерпываются, целостность мембран нарушается, и внутриклеточный гемоглобин становится доступным для озона.
Литература
1. Заводник И.Б., Лапшина Е.А., Степуро И.И. Термостабильность эритроцитарных мембран в присутствии этанола // Биофизика. – 1994. – Т. 39, №3. – С. 470 – 475
2. Калер Г.В., Рачковский Л.И., Матус В.К., Конев С.В. Влияние озона на устойчивость эритроцитов к действию детергентов // Биологические мембраны, 1990. Т. 7, №1. – С. 41 – 46
3. Матвеев А.В., Акоев В.Р., Тараховский Ю.С., Деев А.А., Брюханов В.М., Жадан Г.Г., Шныров В.Л. Сравнительное исследование структурных переходов в эритроцитарных мембранах доноров и новорожденных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1997. – Т. 123, № 2. – С. 196 – 200
4. Fairbanks G., Steck T.L., Mallach D.F. Electroforetic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane // Biochemistry. – 1971. – Vol. 10, №12. – P. 2606 — 2617
5. Gornicki A., Gutsze A. In vitro effects of ozone on human erythrocyte membranes: an EPR study // Acta Biochimica Polonica. – 2000. — Vol. 47, № 4. – P. 963 – 971
6. Snow J.W., Vincentelli J., Brandts J.F. A relationship between anion transport and a structural transition of the human erythrocyte membrane // Biochim. Biophys. Acta. – 1981. – Vol. 642, № 3. – P. 418 – 428
7. Travagli V., Zanardi I., Silvietti A., Bocci V. A physicochemical investigation on the effects of ozone on blood // Intern. Journ. Biol. Macromol. – 2007. – Vol. 41, Issue 5 – P. 504-511