Особенности действия различных доз озона на бактерии Escherichia coli
Высеканцев И.П., Зинченко В.Д., Белых И.А., Бабинец О.М., Буряк И.А..
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
г. Харьков, Украина
Микробицидное действие озона привлекает внимание исследователей в связи с практической значимостью данной проблемы, а также как удобная модель для исследования некоторых общебиологических закономерностей влияния озона на биологические системы. Учитывая высокую активность озона в реакциях с органическими и неорганическими веществами, важно учитывать влияние среды инкубации микроорганизмов при исследовании общего характера воздействия на них озона и при оценках количественных характеристик этого воздействия. Известно, что эффективность воздействия озонированных растворов на микроорганизмы зависит от состава этих растворов [1, 2]. В настоящем исследовании представлены экспериментальные данные о кинетике гибели бактерий E.coli в высушенном состоянии и в различных жидких средах под действием высоких доз озона и о стимулирующем эффекте малых доз озона на пролиферативную активность указанных бактерий.
Исследования проводили на культуре бактерий E.coli, штамм B (из Российской коллекции промышленных микроорганизмов ГНИИ генетики, Москва). В качестве источника озона использовали генератор озона с разрядными трубками
безбарьерного типа [7]. Бактерии выращивали на мясопептонном агаре (МПА) и в минеральной среде М9 [3]. Жизнеспособность бактерий оценивали чашечным методом Коха по числу макроколоний, сформировавшихся на МПА [4]. Логарифмические кривые роста периодических культур бактерий строили по оптической плотности [5].Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым в биологии методам [6].
При изучении влияния высоких доз озона на бактерии в высушенном состоянии использовали герметичную камеру объемом 1 л, в которую помещали бактерии на миллипоровых бактерицидных фильтрах (Millipore USA) и продували озоно-воздушной смесью. Концентрация озона в газовой смеси составляла 6,8 мг/л при потоке 2 л/мин, температура комнатная. Была исследована кинетика гибели бактерий. Через 3 часа обработки озоно-воздушной смесью число КОЕ снижалось c 1,2 ? 108 до 7,8 ? 104, а
через 6 часов все бактерии погибали.
Таким же способом изучали действие озоно-воздушной смеси на бактерии, высеянные на МПА. Было установлено, что в данном случае число КОЕ через 3 часа снижалось на 1 порядок, а через 6 часов все бактерии также погибали.
В экспериментах по изучению влияния озона на клетки в жидкой среде введение озона в суспензию клеток проводили двумя способами. Первый способ состоял в том, что в дистиллированную воду, мясопептонный бульон (МПБ), физиологический раствор вносили бактерии, а затем полученные суспензии барботировали озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л в течение 10, 20, 60 минут. В этом варианте эксперимента было установлено, что бактерии, подвергавшиеся действию озона в дистиллированной воде и физиологическом растворе, погибали к 60 минуте. В МПБ динамика гибели бактерий была менее выраженной, и через 60 минут количество КОЕ снижалось с 2,9 ? 108 до 1,6 ? 103.
При втором способе проведения эксперимента среды инкубации сначала барботировали в течение 30 мин озоно-кислородной смесью с концентрацией озона
6,8 мг/л, затем в озонированную среду вносили бактерии и инкубировали полученные суспензии при 200С в течение 60 минут. Во всех средах через 60 минут полная гибель бактерий не происходила. Инактивирующее действие озона было наименее выраженным в МПБ. При построении кинетических кривых гибели бактерий в жидких средах можно было выделить две фазы снижения концентрации бактерий под воздействием озона. Начальная фаза характеризуется малой гибелью бактерий, а вторая фаза – быстрой гибелью по принципу «доза-эффект».
При культивировании бактерий E.coli в озонированной малыми дозами озона среде М9 установлено, что при дозах до 0,062 мг/л кривые роста бактерий не отличаются от контрольных. При дозах озона 0,12-0,35 мг/л наблюдается стимуляция пролиферативных свойств бактерий и роста периодической культуры. При концентрации озона 0,57 мг/л и выше наблюдается ингибирование роста бактериальной культуры.
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы.
1. Бактерии на сухих поверхностях в меньшей степени повреждаются озоном, чем в водных средах.
2. Летальное действие озона на бактерии в МПБ менее выражено, чем в дистиллированной воде и физиологическом растворе. По нашему мнению, это связано с взаимодействием озона с органическими веществами, входящими в состав МПБ, в результате чего концентрация свободного озона в системе снижается.
3. Экспериментально на примере бактерий E.coli показана стимуляция пролиферативной активности клеток при воздействиии малых доз озона. Возможно, что в этом случае в ростовой среде увеличивается число окисляемых субстратов, необходимых для дыхательного метаболизма бактерий.
Литература
1. Верхнев В.А., Романова М.И. Сравнительная характеристика бактерицидного действия озонированного физиологического раствора различной концентрации//Нижегор. мед. журн. – 2003. Приложение «Озонотерапия». С.18
2. Филатов А.В., Конопельцев И.Г., Черных Е.В. Антимикробные свойства озонированных растворов// Нижегор. мед. журн. – 2003. Приложение «Озонотерапия». С.20
3. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике.–М.:Мир,1976.-436с.
4. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов/Ред. Ерошин В.К.-Пущино: ОНТИ НЦВИ АН СССР.-1990.-186с.
5. Иерусалимский Н.Д.Основы физиологии микробов.-М.: Изд-во АН СССР, -1963.-242с.
6. Статистична обробка результатів біологічних експериментів./Навч. посіб./ Донецк.Університет.-Донецк, 1999.- 186с.
7. Зинченко В.Д., Голота В.И., Сухомлин Е.А., Тарли Г.В., Белых И.А. Лабораторное оборудование для применения озоновых технологий в биологии и медицине//Пробл. криобиологии. – 2005. – Т.15, №4. – с.712-718.